Генная инженерия от A до Z часть 3

Biotechnologies
Краткое содержание предыдущих серий:

Ученые открыли ген синего свечения. Мы прочитали об этом гене загорелись сделать светящуюся трансгенную елку. Нашли в специализированных ресурсах его название и последовательность, выбили командировку у шефа и скатались туда, где живет животное – бутявка, в которой содержится этот ген.
Путем различных ухищрений с применением специального оборудования мы получили чистые молекулы ДНК гена bl1.
К этим молекулам ДНК навесили служебные последовательности для работы внутри клетки, и создали трансгенные бактерии E.coli на их основе.


О трансформации растений.

В идеале, пока мы делали все манипуляции с генами, наш товарищ сосредоточенно работал над тем, что искал, каким образом можно транформировать елку. Если мы просто польем ее раствором ДНК гена bl1, пусть даже со всеми служебными областями, ничего не изменится. Нужно как-то поместить эти молекулы внутрь клетки, причем не просто внутрь клетки, а внутрь молекулы ДНК, находящейся в клеточном ядре.

И это очень сложная задача, сильно зависящая от того, что за организм мы трансформируем.
Агент, который доставляет молекулы ДНК внутрь клетки называется вектором. Вектором может быть просто раствор ДНК, какие-то организмы (бактерии), вирусы, специальные частицы.

Способ доставки

Чаще всего растения трансформируют вектором на основе агробактерии (Agrobacterium tumefaciens). Это такая паразитическая бактерия, которая несет в себе гигантскую плазмиду, называющуюся Ti. Эта плазмида переносит в геном растения-хозияна гены, которые позволяют этой бактерии комфортно существовать. То есть бактрия сама по себе умеет встраивать куски своей ДНК в ДНК растения.

Так вот, бактерию можно обмануть и сконструировать для нее такую Ti плазмиду, чтобы там оставалось все необходимое для переноса, но заменить переносимую часть на ту, которая нам нужна, например на ген bl1 с промотором 35S из вируса табачной мозаики. Этот трюк является основой так называемой агробактериальной трансформации.

К сожалению с елкой не все так просто. Если честно, я вообще не слышал, чтобы ее смогли трансформировать. Для таких трудных объектов часто единственный способ – это прямая баллистическая трансформация или gene gun.

Это дорогой и сложный, но универсальный способ доставки ДНК внутрь клетки. Он заключается в том, что молекулы ДНК налепливают на микрочастицы золота, которыми потом выстреливают с большой скоростью в культуру клеток. В часть клеток эти частицы попадают и оставляют молекулы ДНК, которые с довольно низкой вероятностью встраиваются в геном.

Прибор для баллистической трансформации

Что именно мы трансформируем?

Но, ведь даже если акт встраивания произойдет, он произойдет в одной клетке! Она как-то должна выжить среди массы других.
Для этого используется генетический маркёр, который содержится в ДНК, которой мы выстрелили. Этим маркером может быть ген устойчивости к гербициду (веществу, ядовитому для растений).

Культуру клеток после выстреливания помещают на среду с гербицидом, к которым устойчивы только трансформированные клетки. На картинке видно, что часть каллусов желтая — мертвая, а часть зеленая. Вот так и проявляется действие гербицида. Каллусом называется неорганизованная масса недифференцированных растительных клеток.

image

Вы заметили что везде я веду речь не о целом растении, а о культуре его клеток? Это важное дополнение, невозможно «мутировать», то есть трансформаировать весь организм сразу (кстати, камень в огород безграмотных sci-fi про мутантов). Приходится работать с отдельными клетками. Приходится — потому что это сложно и неудобно, клетки вне организма очень капризны и часто не хотят расти так как нам нужно.

Получение живой культуры клеток — это отдельная биотехнологическая задача, о которой речь более иди не будет, так как она слишком сложна для включения в эту статью.
Но в любом случае для работы с культурами клеток еще и стерильные условия, которые можно обеспечить, только приобретя ламинар-бокс и автоклав. Культуры клеток растут на особых средах в чашках Петри. В среды добавляют разные вещества для роста – соли, сахара и самое главное – определенный состав гормонов, который побуждает клетки делиться или формировать взрослые растения.

image

Конкретные шаги.

Это было лирическое вступление, а теперь пойдет проза. Весь процесс разбивается на несколько стадий.

Плазмида

Берем нашу плазмиду с имеющимися служебными последовательностями, вырезаем оттуда нужный кусочек (методами, описанными в части 2) и помещаем в купленную векторную плазмиду для переноса в растения. Этой плазмидой трансформируем агробактерии (методы так же описаны в предыдущей статье). Сразу с агробактериями мы не работаем потому что они значительно менее удобны чем E.coli и хуже растут.

Культура клеток

Параллельно мы пытаемся получить стерильную клеточную культуру растения, используя литературные и собственные данные о том, на какой питательной среде лучше всего растут клетки этого вида. В качестве исходного материала для клеточной культуры используют семена или черенки, которые на среде с добавкой гормонов разрастаются в неорганизованную массу клеток — каллус. Обычно процесс получения культуры клеток занимает 1-2 месяца (так как обычно они растут медленно).

Культура бактерий

После этого мы выращиваем культуру агробактерии или подготавливаем частицы золота с напылением ДНК для трансформации, в зависимости от того, какой способ подходит для этого вида растения.

Трансформация

Теперь у нас все есть для трансформации. Мы проводим инкубацию с бактериями (около часа), либо выстрел частичками золота с помощью gene gun.

Отбор трансформантов

Помещаем на среду с антибиотиками для убивания остатков бактерий и гербицидом для того, чтобы выросли лишь трансформированные клетки.

Регенерация

Через некоторое время трансформированные клетки формируют колонии – каллусы. Эти каллусы высеваются на среду с добавкой растительных гормонов (ауксинов и цитокининов) для регенерации.

image

Мы получаем трансгенные растения (в нашем случае — светящуюся елку)!

Далее нам предстоит испытать их на наличие вставки, ее работоспособность, но это уже отдельный разговор.

Вот схема процесса для улучшения понимания:

image

Как и в любом научном эксперименте, при трансформации обязательно нужно ставить контроли, то есть эксперименты, показывающие нам, что все сделано правильно.
Положительным контролем для получения трансгенного растения служит трансформация с помощью купленного тестового вектора с наличием определенных маркеров. Если она произойдет, то это покажет нам, что мы все делаем правильно и наша методика подходит.

Отрицательным контролем служит отсутствие трансформации и помещение клеток сразу на среду с гербицидом. Для чего это нужно? Чтобы не оказалось, например, что такой дозы гербицида недостаточно для полного подавления роста нетрансформированных растений.

Если проведен положительный и отрицательный контроль, а трансформация не удалась, то это значит, что проблемы в нашей конструкции и нужно все переделывать

Ну а как вы хотели, генетическая инженерия непростая вещь :)

Помните, постановка контрольных реакций на каждой стадии эксперимента – необходимое условие для того, чтобы быть уверенным, что все идет как надо.


Вот и все, по-моему я обрисовал как мог процесс получения трансгенных растений в лаборатории. Надеюсь, информация показалась вам интересной :)

Заключение.

Помнится, я обещал посчитать стоимость оборудования (исходя из реальной стоимости про покупке б/у) и реактивов для осуществления этого процесса.

Амплификатор – 30 тысяч рублей
Центрифуга настольная – 20 тысяч
Реактивы (в виде готовых наборов) – 30 тысяч
Источник тока, форезная камера, УФ лампа (трансиллюминатор) – 30 тысяч
Ламинар-бокс – 90 тысяч
Автоклав настольный – 50 тысяч
Автоматические дозаторы от 0,5 до 1000 мкл — 25 тысяч
Весы лабораторные — 20 тысяч
Расходный пластик (пробирки, наконечники дозаторов, чашки петри и т.д.) — 7 тысяч
Программное обеспечение для работы с последовательностями ДНК– по-хорошему может стоить больше 1000$, но можно обойтись без него или использовать триальные версии.

Стоимость помещения и т.д. я не рассматриваю, так как оно слишком индивидуально.

В принципе видно, что с оснастить генетическую лабораторию могут довольно многие, было бы желание и умение. На сегодняшнем этапе оборудование дорогое, но не стоит космических денег.

А вообще, у меня есть серьезное ощущение, что генная инженерия сейчас только в начале своего долгого пути, так что и знания о ней будут не лишними никому :) Вряд ли распространение получат лаборатории «на коленке», но уже нет сомнений, что генетические технологии прочно войдут в медицинскую, пищевую отрасль, криминалистику. И кто знает, как оно пойдет дальше.

2all Извиняюсь за такую задержку в выпуске третьей части, она была написана давно, но никак не было времени ее довести до ума и опубликовать.

Ссылки на предыдущие части статьи:
Первая часть: https://geektimes.ru/post/48533/
Вторая часть: https://geektimes.ru/post/48846/
Tags:генная инженерияднкбиотехнологии
Hubs: Biotechnologies
+87
10.1k 95
Comments 64
Frontend-разработчик (Pixi+React)
from 120,000 ₽ZetaSoftRemote job
Team Lead
from 130,000 to 180,000 ₽СКИФ ЭППМосква
Senior Frontend
from 200,000 ₽AaplyRemote job
HR-менеджер / IT-рекрутер
from 100,000 ₽Российский квантовый центрRemote job
PHP-программист, удаленно
from 60,000 ₽Югорские Интернет РешенияRemote job